Механізми алкоголь-індукованого ураження слинних залоз, модельованого на тлі системної запальної відповіді, та їхня корекція поліфенолами

Abstract

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і розв’язання наукового завдання, що полягає у з’ясуванні закономірностей розвитку алкогольного ураження слинних залоз (СЗ) за умов ліпополісахарид (LPS)-індукованої системної запальної відповіді (SIR) та експериментальному обґрунтуванні застосування поліфенолів як засобів патогенетичної терапії. Експерименти виконані на 56 щурах лінії Wistar масою 205-220 г. Використано такі методи дослідження: експериментальні (моделювання алкогольного ураження СЗ, LPS-індукованої SIR, терапевтичний вплив поліфенолів), імуноферментні (визначення вмісту в сироватці крові прозапальних і протизапального цитокінів, гострофазового Среактивного протеїну, концентрації аквапоріну (AQP) 5 в гомогенаті СЗ), біохімічні (визначення швидкості утворення супероксидного аніонрадикала, активності NO-синтази та її ізоформ, концентрації пероксинітритів і S-нітрозотіолів, вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів, активності супероксиддисмутази (SOD), каталази (CAT) та α-амілази (AA) в гомогенаті СЗ), а також статистичні. Показано, шо введення алкоголю на тлі LPS-індукованої SIR супроводжується зростанням прозапальної гіперцитокінемії (вміст фактора некроза пухлин-α та інтерлейкіну-6 у сироватці крові збільшується в 1.9 та 2.3 раза, р<0.001), що не компенсується рівнем протизапального інтерлейкіну-10, а також істотним збільшенням вмісту C-реактивного протеїну в сироватці крові, що вірогідно перевищує такий при окремому введенні LPS та 40 %-го етанолу. Вперше показано, що застосування алкоголю на тлі LPSіндукованої SIR супроводжується більш значним розвитком оксидативно-нітрозативного стресу в тканинах піднижньощелепних СЗ порівняно з групами з окремим введенням LPS та 40 %-го етанолу, що виявляється у збільшенні продукції супероксидного аніон-радикала (мікросомальними монооксигеназами на 70.2 %, дихальним ланцюгом мітохондрій на 84.6 %, NADPH-оксидазою фагоцитів на 74.1 %, р<0.001), активності індуцибельної ізоформи NO-синтази на 160.0 % (р<0.001), вмісту активних метаболітів азоту (пероксинітритів на 79.1 % і S-нітрозотіолів на 58.7 %, р<0.001), концентрації вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів – TBA-активних продуктів на 199.0 % (р<0.001), зменшенні активності SOD на 65.2 % (р<0.001). За цих умов у гомогенаті піднижньощелепних СЗ значно поступається відповідним значенням груп з окремим введенням LPS та застосуванням 40 %-го етанолу активність AA (на 34.8 %, р<0.001) та концентрація AQP5 (на 64.7 %, р<0.001). Вперше доведено, що застосування куркуміну, епігалокатехіну-3-галату, кверцетину та ресвератролу за умов поєднаного введення 40%-го етанолу та LPS суттєво знижує ознаки системної запальної відповіді (вірогідно зменшується концентрація в крові прозапальних цитокінів – фактора некрозу пухлин-α на 41.3, 27.6, 39.7 та 34.6 % відповідно, інтерлейкіну-6 на 51.2, 47.8, 55.2 та 58.3 % відповідно, а також реактанта гострої фази запалення – C-реактивного протеїну на 32.1, 32.2, 32.0 та 30.4 % відповідно), та суттєво збільшує концентрацію протизапального цитокіна – інтерлейкіну-10 в 3.21, 3.37, 3.85 та 2.83 раза відповідно. Призначення куркуміну та біофлавоноїдів (епігалокатехіну-3- галату та кверцетину) за умов експерименту суттєво обмежує розвиток оксидативно-нітрозативного стресу в тканинах піднижньощелепних СЗ, що підтверджується вірогідним зменшенням продукції супероксидного аніон-радикала (мікросомальними монооксигеназами на 31.6, 29.1 та 36.3 %, дихальним ланцюгом мітохондрій на 36.8, 34.5 та 41.3 %, NADPH-оксидазою фагоцитів на 38.6, 36.6 та 43.9 % відповідно), активності індуцибельної ізоформи NO-синтази на 47.0, 38.3 та 52.0 % відповідно, концентрації активних метаболітів азоту (пероксинітритів на 35.6, 37.4 та 39.3 % і S-нітрозотіолів на 34.5, 31.1 та 35.3 % відповідно), обмеженням утворення вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів – ТБК-активних сполук на 59.3, 55.7 та 67.0 % відповідно. За цих умов у тканинах піднижньощелепних СЗ підвищується індекс спряження сNOS на 73.8, 90.5 та 111.0 %, антиоксидантний потенціал на 50.6, 44.5 та 52. 4%, активність SOD в 2.87, 2.37 та 2.75 раза, активність каталази в 2.84, 2.30 та 2.84 раза відповідно, а також покращуються показники функціонального стану СЗ (збільшується активність AA на 40.4, 38.2 та 34.1 % та концентрація AQP5 у 2.66, 2.61 та 2.55 раза відповідно). Застосування природного стильбену ресвератролу за умов поєднаного введення 40 %-го етанолу та LPS ефективно обмежує розвиток оксидативно-нітрозативного стресу в тканинах піднижньощелепних СЗ, що підтверджується вірогідним зменшенням продукції супероксидного аніон-радикала різними джерелами (мікросомальними монооксигеназами на 28.3 %, дихальним ланцюгом мітохондрій на 33.0 %, NADPH-оксидазою фагоцитів на 35.3 %), активності індуцибельної ізоформи NO-синтази на 39.7 %, концентрації активних метаболітів азоту (пероксинітритів на 36.8 % і S-нітрозотіолів на 42.0 %), обмеженням утворення ТБК-активних сполук на 48.4 %. Введення ресвератролу за умов експерименту суттєво збільшує в тканинах піднижньощелепних СЗ індекс спряження сNOS в 2.23 раза, антиоксидантний потенціал на 39.2 %, активність SOD та каталази в 2.5 та 2.23 раза відповідно, активність AA на 40.3 % та концентрацію AQP5 в 2.77 раза. Результати досліджень розширюють і доповнюють існуючі уявлення про механізми алкогольного ураження СЗ на тлі системної соматичної патології, що супроводжується системною запальною відповіддю. Результати роботи обґрунтовують можливості патогенетичної терапії патології СЗ при їх алкогольному ураженні за умов SIR поліфенолами (куркуміноїдами, флавоноїдами та стильбеноїдами) та доводять доцільність подальшого доклінічного та клінічного дослідження куркуміну, епігалокатехіну-3-галату, кверцетину та ресвератролу як протекторів СЗ. This dissertation presents a novel conceptual synthesis and solution of the scientific problem aimed at revealing the mechanisms of the development of alcohol-induced damage to salivary glands (SG) under the lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory response and providing the experimental substantiation for using polyphenols to correct the damage. The experiments were performed on 56 white Wistar male rats weighing 205 – 220 g. The methodology includes experimental techniques (alcohol damage modelling, LPS-induced SIR, therapeutic effect of polyphenols), enzyme immunoassay (determining the content of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in blood serum, acute-phase C- reactive protein, and the concentration of aquaporin 5 in the SG homogenate), biochemical methods (measuring the superoxide anion radical formation rate, the activity of NO-synthase and its isoforms, the concentration of peroxynitrite and S-nitrosothiols, secondary products of lipid peroxidation, the activity of superoxide dismutase, catalase and α-amylase in the NW homogenate), and statistical methods. The study has demonstrated the administration of alcohol under the LPS-induced SIR is accompanied with growing pro-inflammatory hypercytokinemia (the levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the blood serum increases 1.9-fold and 2.3-fold, р<0.001) that is not compensated by the level of anti-inflammatory interleukin-10, as well as a significant increase in the content of C-reactive protein in the blood serum, which probably exceeds that under the separate administration of LPS and 40% ethanol. The results obtained have revealed the ethanol administration under LPS-induced SIR is accompanied by the more pronounced development of oxidative-nitrosative stress in the tissues of the submandibular SG compared to the groups exposed to the separate administration of LPS and 40% ethanol that is manifested by an increase in the production of the superoxide anion radical (by microsomal monooxygenases by 70.2%, by the mitochondrial respiratory chain – by 84.6%, by the phagocyte NADPH oxidase – by 74.1%, p<0.001), in the activity of the inducible isoform of NO-synthase by 160.0% (p<0.001), in the content of active nitrogen metabolites (peroxynitrite by 79.1% and S -nitrosothiols elevates by 58.7%, p<0.001), in the concentration of secondary products of lipid peroxidation, TBC-reactants, by 199.0% (p<0.001), and by the reduction of superoxide dismutase activity by 65.2% (p<0.001). Under these conditions, the α-amylase activity (by 34.8%, p<0.001) and the concentration of aquaporin 5 (by 64.7%, p<0.001) in the homogenate of the submandibular SGs are significantly inferior to the respective values in the groups exposed to the separate administration of LPS and the use of 40% ethanol. This study have provided sound grounds that the application of curcumin, epigallocatechin-3-gallate, quercetin, and resveratrol under the conditions of the combined administration of 40% ethanol and LPS significantly reduces the signs of the systemic inflammatory response (the concentration of pro-inflammatory cytokines in the blood significantly decreases, and namely, tumor necrosis factor-α lessens by 41.3, 27.6, 39.7 and 34.6%, respectively, interleukin-6 lowers by 51.2, 47.8, 55.2 and 58.3%, respectively, as well as C-reactive protein, an acute phase reactant, decreases by 32.1, 32.2, 32.0 and 30.4%, respectively, at the same time there is a significant increase in the concentration of interleukin-10, an antiinflammatory cytokine, in 3.21, 3.37, 3.85 and 2.83 times, respectively. The use of curcumin and bioflavonoids (epigallocatechin-3-gallate and quercetin) under the experimental conditions significantly restrains the development of oxidative-nitrosative stress in the tissues of the submandibular SG that is confirmed by a significant decrease in the production of the superoxide anion radical (by microsomal monooxygenases by 31.6, 29.1 and 36.3%, by the respiratory chain mitochondria by 36.8, 34.5, and 41.3%, and by the phagocyte NADPH oxidase by 38.6, 36.6, and 43.9%, respectively), the activity of the inducible isoform of NO synthase by 47.0, 38.3, and 52.0%, respectively, the concentration of active nitrogen metabolites (peroxynitrites by 35.6, 37.4, and 39.3 % and S-nitrosothiols by 34.5, 31.1, and 35.3%, respectively), and by restricting the production of secondary products of lipid peroxidation, TBC-reactive compounds, by 59.3, 55.7, and 67.0%, respectively. Under these conditions, the cNOS coupling index grows up by 73.8, 90.5, and 111.0%, antioxidant potential elevates by 50.6, 44.5, and 52.4%, superoxide dismutase activity increases in 2.87, 2.37, and 2.75 times, and catalase activity rises in 2.84, 2.30, and 2.84 times respectively; the indicators of the SG functional state also improve (the activity of α-amylase increases by 40.4, 38.2, and 34.1% and the aquaporin 5 concentration rises in 2.66, 2.61, and 2.55 times, respectively). The use of the a natural stilbene, resveratrol, under the combined administration of 40% ethanol and LPS effectively restrains the development of oxidative-nitrosative stress in the tissues of the submandibular SG that is confirmed by a significant decrease in the production of the superoxide anion radical by various sources (microsomal monooxygenases by 28.3%, the mitochondrial respiratory chain o by 33.0 %, by the phagocyte NADPHoxidase by 35.3%), the activity of the inducible isoform of NO-synthase by 39.7%, the concentration of active nitrogen metabolites (peroxynitrites by 36.8% and S-nitrosothiols by 42.0%), by the restrained formation of TBCreactive compounds by 48.4%. The administration of resveratrol under the experimental conditions significantly increases cNOS coupling index in 2.23 times, antioxidant potential by 39.2%, and the activity of superoxide dismutase and catalase in 2.5 and 2.23 times, respectively, the α-amylase activity by 40.3%, and aquaporin 5 concentration in 2.77 times. The obtained results provide more exact and detailed information on the mechanisms of alcohol damaging effect to salivary glands under systemic pathology, which is accompanied with the systemic inflammatory response. The results of the investigation substantiate the expediency of applying the pathogenetically based approach in the therapy of salivary glands affected with alcohol under the systemic inflammatory response. This study gives robust evidences to include polyphenols (curcuminoids, flavonoids and stilbenoids) in the above mentioned therapy and substantiate the expediency of further pre-clinical and clinical research of curcumin, epigallocatechin-3- gallate, quercetin and resveratrol as protectors for salivary glands.